Новый метод диагностики дерматофитов – иммунохроматографический анализ. Сравнительная оценка эффективности и достоверности ИХА метода в диагностики дерматофитов в ветеринарной медицине мелких домашних животных.



Автор (ы):  И.В. РУБЛЕВСКАЯ, ветеринарный врач
Журнал:  №1-2020

Цель: оценить эффективность и достоверность метода ИХА с целью дальнейшего применения как самостоятельный рутинный метод исследования в общей ветеринарной практике.

Материалы и методы 

Проведено исследование 100 случайных животных на базе клиники. Животные не имели одинаковой клинической картины заболевания, были разного возраста, разных физиологических групп и имели различные условия содержания. Для диагностики дерматофитии применялись доступные и существующие на сегодняшний день методы исследования (кроме биопсии), а именно культуральные исследования, микроскопия, люминесцентная диагностика и ПЦР. Животных отобрали по группам:

  • • с клиническими проявлениями;
    • без клинических проявлений, но в контакте с больными; 

  • • без клинических проявлений, взятые с улицы.

Результаты 
Ни один из существующих методов исследования не может быть эталонным и единственным в диагностике дерматофитии, как и заявлялось ранее*. Существует много нюансов, как в отборе материала для каждого из методов диагностики, так и в интерпретации результатов. Для достоверной диагностики дерматофитии необходимо применять несколько методов одновременно. ИХА-диагностика показала хорошие результаты в клинических исследованиях и может быть полезна в рутинном обследовании животных. Однако требуется еще доработка тест-систем с дальнейшими клиническими исследованиями (табл. 1).

Введение

Дерматофитоз – это инфекция кератинизированных тканей, когтей, волос и рогового слоя, вызванная грибами видов Microsporum, Trichophyton или Epidermophyton. Эти организмы – дерматофиты являются уникальными грибами, способными проникать и удерживаться в кератинизированных тканях. Дерматомикоз – это грибковая инфекция волос, когтей или кожи, вызванная недерматофитом, грибком, не относящимся к родам Microsporum, Trichophyton или Epidermophyton.

Дерматофитоз и дерматомикоз – это разные клинические проявления.

Клинические проявления у животных разнообразны и не специфичны. От этого затруднена диагностика,

которая является неспецифической и во многом зависит не только от опыта врача в данной области, но и от выбора самого метода исследования, что часто приводит к ложноположительным и ложноотрицательным результатам.

Материалы и методы диагностики

В ветеринарной медицине существует несколько методов диагностики дерматофитов.

1. Люминесцентная диагностика при помощи ультрафиолетового света со световой волной 253,7 нм, ко- торый фильтруется через кобальтовый или никелевый фильтр.

При воздействии ультрафиолетового света волоски, пораженные M. canis, могут вызывать желто-зеленую флуоресценцию.

Флуоресценция происходит из-за метаболитов триптофана, продуцируемых грибом. Эти метаболиты вырабатываются только грибами, которые проникли в активно растущие волосы и не могут быть вызваны инфекцией волос in vitro. Флуоресценция отсутствует в чешуйках или корках, или в культурах дерматофитов. Другие менее распространенные дерматофиты, которые могут флуоресцировать, включают Microsporum distortum, M. audouinii и Trichophyton schoenleinii.

Многие факторы влияют на флуоресценцию. Использование лекарств, таких как йод, разрушает его. Бактерии, такие как Pseudomonas aeruginosa и Corynebacterium minutissimum, могут флуоресцировать, но иметь другой цвет в отличии от инфицированных дерматофитами волос. Кератин, мыло, масло и другие лекарства могут флуоресцировать и давать ложноположительные реакции.

Отрицательный результат не исключает инфекцию, флуоресцирующие волоски удобно отбирать на ми- кроскопию и посев.

Проверка лампами на флуоресценцию приводит только к определенным штаммам M. canis, M. audouinii, M. distortum и Trichophyton schoenleinii для получения положительного желто-зеленого цвета.

2. Микроскопическое исследование подозрительных волос или соскоба чешуек может выявить гифы и артроспоры в 40–70% случаев, и это явное свидетельство дерматофитоза. Прямая микроскопия волоса является значимой для постановки диагноза «микроспория». При микроскопии можно обнаружить деформированные или полностью разрушенные спорами дерматофитов волосы. Внешне корень волоса можно спутать с волосом, разрушенным спорами, поэтому при обнаружении подозрительного участка волоса необходимо провести детальное исследование всего стержня волоса. Обнаружение одного участка поражения волоса в материале не может быть основанием для установки окончательного диагноза дерматофития.

3. Культуральные исследования.

Наиболее достоверный способ диагностики дерматофитозов, позволяющий получить культуру на среде и идентифицировать возбудителя до вида. Однако точность исследования зависит от соблюдения всех правил выполнения данного метода. Недостатком является длительность исследования (колонии растут в течение 7-21 дней).

Тест-среда Сабуро с декстрозным агаром и дермато- фитом (DTM) традиционно используется в клиниче- ской ветеринарной микологии для выделения грибов.

Окончательный диагноз ставится посредством микроскопии. Обнаружение макроконидий при микроскопии является основанием для постановки окончательного диагноза дерматофитии.

Для идентификации вида дерматофитов проводят микроскопию. Разные виды дерматофтитов имеют разные по строению макроконидии.

Trichophyton rubrum

100%

Trichophyton tonsurans

82-122%

Microsporium canis

75-111%

Fusarium spp.

23-81%

Aspergillus repens

18-48%

Aspergillus spp

0-2.5%


 4. Цитологическая диагностика.

Взятие материала для исследования возможно с мокнущих поражений с помощью скотч-отпечатка с последующей окраской образца стандартными красителями, а также с нодулярных поражений с помо- щью тонкоигольной биопсии. Цитологическое исследование позволяет обнаружить споры грибов.

Важно учитывать, что вероятность обнаружения спор в таком материале низкая. Данный метод диагностики предпочтителен при наличии у животного поражений в виде нодул (кериона), так как споры будут локализованы очагово внутри данного поражения. При проведении цитологического исследования с поверхностных поражений вероятность обнаружения спор меньше из-за влияния внешних факторов. Данный метод не может быть рутинным, так как врач, который будет проводить исследование, должен обладать большим опытом в идентификации спор грибов.

5. ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Эти методы обладают хорошей диагностической ценностью, но повсеместно в практике не используются.

Иммунологический метод исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Метод ПЦР, в котором выявляется геном возбудителя, позволяет точно дифференцировать возбудителя. Метод обладает высокой чувствительностью, поэтому даже минимальные количества возбудителя могут быть обнаружены в клиническом материале.

Сложности данного исследования заключаются в сборе материала и возможности определения только одного ДНК-гриба за одну пробу. Также имеет значение, что метод дорогостоящий и не все лаборатории проводят его.

6. Иммунохроматографический анализ (ИХА), основанный на принципе иммунохроматографии и при- меняется для качественного обнаружения общего антигена дерматофитных грибов. Во время проведения теста антиген связывается специфическими антителами, нанесенными на тест-полоску и на поверхность окрашенных микрочастиц. В результате их взаимодействия образуется комплекс, видимый в форме цветной линии. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет. Чувствительность определения составляет примерно 0,25 мкг/мл сухой массы мицелия Trichophyton rubrum. Данный расчет является приблизительным и зависит от сохранности исследуемого материала, метода его хранения и экспрессии специфических антигенов, зависящих от климатических условий, вида и штамма гриба. Видовой охват и перекрестные реакции ХЕ- МАtest. Дерматофиты с другими грибами изучали на экстрактах мицелиев, полученных экстракцией изотоническим нейтральным буфером для экстракции (0,1 M фосфатно-солевой буфер с pH 7.2-7.4). Полученные концентрации нормировали по содержанию общего белка (метод Лоури) и выражали в процентах от соответствующей концентрации главного определяемого антигена.

Данный тест определяет антиген в вегетативной форме гриба и практически не определяет антиген в спорах. Не обнаружено значимой перекрестной реакции (< 0,1%) со следующими родами и видами: Candida, Saccharomyces cerevisiae, Mucor, Rhizopus, Thamnidium, Phoma, Alternaria, Trichoderma, Phytophtora, Pythium, Penicillium, Cladosporium, Ustilago, Botrytis, Geomyces, Ascochyta, Claviceps, Neurospora, Acremonium. При трактовке результатов важно учитывать крайнюю степень антигенного полиморфоза некоторых родов грибов; это затрудняет экстраполяцию найденного антигенного родства у конкретного вида на другие виды того же рода, а тем более близких родов.

7. Гистологическое исследование

Не является рутинным методом, но гистопатологическое исследование незаменимо при подозрении на псевдомицетому и керион. Зачастую взятие материала для биопсии проводится при отрицательных результатах всех ранее перечисленных методов. Наиболее диагностичный результат дает PAS-окраска, которая позволяет прокрашивать гифы и споры внутри фолликула и эпидермиса.

Клинические испытания

Целью исследований было оценить точность ИХА- тестов по сравнению с другими уже имеющимися ранее методами диагностики. И возможность применения в качестве самостоятельного метода диагно- стики в рутинном исследовании. Также важным критерием была скорость выполнения метода и цена исследования.

Всего проведено исследование 100 случайных животных на базе клиники (табл. 1). Животные не имели одинаковой клинической картины заболевания, были разного возраста, разных физиологических групп и имели различные условия содержания. Применяли доступные и существующие на сегодняшний день методы исследования (кроме биопсии). Критерии отбора животных по группам:

- с клиническими проявлениями

- без клинических проявлений, но в контакте с больными

- без клинических проявлений, взятые с улицы

Всем испытуемым было проведено ИХА тестирование, ЛД тест и микроскопия.

Животным имеющим кожные поражения и при положительном результате ИХА теста либо ЛД теста (или и того и другого) были дополнительно проведены культуральные исследования и/или ПЦР исследования.

Так же было 5% животных имеющий отрицательные результаты по ИХА, но положительный по ЛД и микроскопии. Такие данные вероятно были связаны с нарушением техники взятия материала для исследования.

1% животных дали положительные результаты по ПЦР. Из анамнеза данное животное содержалось вместе с больным. испытания:

Таблица 1. Количество положительных результатов у испытуемых групп

100 животных

кол-во

животных

ЛД

Микро-

скопия

Культуральные

исследования

ПЦР

ИХА

без клинический

поражений

48

0

0

0

0

0

с клиническими

поражениями

24

20

16

11

4

19

в контакте , но без клинических поражений

28

1

1

0

1

11


   










Таблица 2 Результаты сравнения методов по основным критериям отбора

доступность

на приеме

точность

метода

время

до получения

результатов

цена

метода

(рубли)

люминисцентная

диагностика

да

нет

5-7  минут

100-150

микроскопия

Да\нет

Да\нет

5-15 минут

200-300

посев

нет

Да\нет

до 21 дня

1500-2500

ПЦР

нет

Да\нет

2-3 дня

700-1200

ИХА

да

да

10 минут

до500

биопсия

-

да

3-6 недель

 

2500-5000

   

Обсуждение

Ни один из существующих методов исследования не может быть эталонным и самостоятельным в диагностики дерматофтии, как и заявлялось ранее. * Существуют много технических и профессиональных аспектов важных для отбора проб и интерпретации результатов.  Для достоверной диагностики дерматофитии рекомендовано применять несколько методов одновременное. ИХА диагностика показала хорошие результаты в клинических исследованиях и может быть полезна в рутинном обследовании животных. Достоверность ИХА теста напрямую коррелирует с методикой взятия материала.  Малое количество образца или предварительная обработка животного моющими средствами может привести к получению ложноотрицательных либо ложноположительных результатов. Рекомендуется строго соблюдать правила отбора материала и технику выполнения метода в соответствии с инструкциями производителей. Даже при соблюдении всех правил отбора проб и выполнения методики были получены отрицательные результаты в случаях подтвержденной дерматофитии с помощью других методов диагностики (микроскопия, культуральные исследования).  Безоговорочными преимуществами ИХА теста относительно других методов диагностики дерматофитии являются: быстрая скорость проведения исследования; низкая стоимость; возможность диагностики «здесь и сейчас»; отсутствие необходимости в специальном оборудовании.  

Однако требуется еще доработка тест-систем с дальнейшими клиническими исследованиями.

 

*Diagnosis and treatment of dermatophytosis in dogsand cats.Clinical Consensus Guidelines of the World Association for Veterinary Dermatology Karen A. Moriello*, Kimberly Coyner†, Susan Paterson‡ and Bernard Mignon






Назад в раздел