Еще фото

Автор (ы):  Н.В. Митрохина, к.в.н., ветеринарный врач-патоморфолог, генеральный директор «Ветеринарного центра патоморфологии и лабораторной диагностики доктора Митрохиной»
Журнал:  №4-2017

УДК: 619:616.5-006.81

Иммуногистохимический метод исследования тканей опухолей применяется в медицинской практике широко и довольно давно. К сожалению, в ветеринарии этот метод только «набирает обороты», а первые попытки его использования были предприняты не более 10 лет назад. В большинстве случаев это связано с тем, что ветеринарные врачи не понимают значимости данного исследования и не умеют интерпретировать результаты этого анализа. Область применения иммуногистохимического исследования широка. Данный метод используют для верификации низкодифференцированных опухолей, определения линейной принадлежности лимфом, установления гистогенеза опухоли, определения прогностических факторов и выявления чувствительности ткани опухоли к химиотерапевтическим препаратам. Наиболее простое назначение метода заключается в дифференциальной диагностике опухолей, имеющих сходные морфологические черты. Данную область применения лучше рассмотреть на примере клинического случая.

Введение

В основе иммуногистохимических (ИГХ) методов лежит принцип специфического взаимодействия тканевых и клеточных антигенов со специально полученными антителами, имеющими на себе разнообразные метки. Т.е. это метод исследования, основанный на выявлении наличия и локализации определенных антигенов в клетках и тканях при помощи специфических антител.

Изучая конкретные молекулы, иммуногистохимия позволяет получать информацию о функциональном состоянии клетки, ее взаимодействии с микросредой, устанавливать фенотип и принадлежность клетки к определенной ткани. Так, исследование содержания в клетке анти- и проапоптотических факторов позволяет судить о состоянии системы апоптоза в клетке. Изучение рецепторного аппарата дает возможность глубже понять межклеточные взаимоотношения при различных патологических процессах.

Результаты подобных исследований необходимы для изучения процессов дифференцировки и катаплазии клеток, что имеет принципиальное значение в установлении гистогенеза опухолей, их диагностике и прогнозе. Например, определение гистохимическими методами гистопринадлежности новообразования позволяет четко идентифицировать тип сарком, лимфом, опухолей центральной нервной системы, низко- и недифференцированых опухолей.

Наиболее успешно метод применяется в диагностике гематопоэтических, лимфопролиферативных новообразований, мягкотканных сарком. Описано несколько десятков лейкоцитарных маркеров (CD-антигены), часть которых является маркерами направления, степени дифференцировки, созревания, трансформации клеток, а часть – обладает специфическими функциями.

Для ИГХ-анализа опухолей и их метастазов применяется широкий спектр маркеров, к которым можно отнести: тканеспецифичные (белки промежуточных филаментов, компоненты базальной мембраны, рецепторы и др.), цитоспецифичные (CD-антигены лейкоцитов, миоглобин, гладкомышечный актин и др.), опухолеассоциированные антигены, опухолевые маркеры, гормоны, ферменты и белковые продукты клеточных онкогенов, генов-супрессоров и т.д. Некоторые ИГХ-маркеры имеют специфическую ультраструктурную локализацию, другие – располагаются либо на различных органеллах, либо в цитозоле или внеклеточно.

Меланома

Высокозлокачественная опухоль, поражающая кожу и слизистые оболочки животных. У собак обнаруживается значительно чаще, чем у кошек. Важным обстоятельством является то, что у людей меланома развивается на фоне ранее существовавшего пигментного невуса, а у собак – на фоне темного окраса кожи или слизистых оболочек.

Опухоль имеет нейроэктодермальное происхождение. Меланобласты (предшественники меланоцитов) возникают в невральном гребешке и в последующем мигрируют в эпидермис. Меланома исходит из меланоцитов или невусных клеток. Меланоциты располагаются в базальном слое эпидермиса по линии дермоэпидермальной границы, основной их функцией является синтез меланина, который захватывается и накапливается эпидермальными клетками. Если происходит малигнизация меланобластов – клеток, еще не способных синтезировать пигмент (т.е. низкодифференцированных), то развивается амеланотическая меланома, которая имеет более агрессивное биологическое поведение. Если же произошла малигнизация меланоцитов, синтезирующих пигмент, то развивается пигментосодержащая меланома. Морфологически различают 3 варианта меланом: веретеноклеточную, эпителиоидноклеточную и смешанную. В развитии меланом различают две фазы: горизонтальную и вертикальную. Горизонтальная фаза характеризуется развитием опухоли в пределах эпителиального пласта, она быстро переходит в вертикальную, характеризующуюся проникновением опухоли в поверхностные слои эпидермиса и инвазией в подкожную жировую клетчатку. Меланома склонна к рецидивированию и метастазированию гематогенным и лимфогенным путем.

Морфологически меланома состоит из веретенообразных или эпителиоидных клеток, имеющих крупные овальные или округлые ядра, содержащие глыбчатый грубый хроматин и множественные крупные нуклеолы. Цитоплазма клеток обильная, светлая или содержит пигмент. Пигмент в меланоме может визуализироваться и как наличие крупных грубых черных гранул, и как еле заметная «запыленность» цитоплазмы. В случае амеланотической меланомы диагностика может вызывать затруднения. Клетки опухоли формируют пучки или псевдоальвеолярные структуры. Возможно наличие очагов некроза или кровоизлияний. Васкуляризация ткани – от скудной до обильной. Часто в ткани опухоли представлена соединительнотканная строма. Крайний полиморфизм структуры опухоли заставляет проводить дифференциальную диагностику с саркомами (в случае беспигментных веретеноклеточных форм), раками (в случае беспигментныхэпителиоидноклеточных форм) и даже нейроэктодермальными опухолями (поскольку меланома имеет нейроэктодермальный гистогенез). Для подобной дифференциальной диагностики применяется ИГХ-метод исследования.

Маркеры для верификации меланом

HMB 45. Реактивный антиген представлен в кожных меланоцитах, пренатальном и неонатальном пигментном эпителии сетчатки и меланомных клетках и считается по своей природе онкофетальным. Эти антитела окрашивают большинство меланосом.

Синаптофизин является основным маркером, пожалуй, маркером первой линии для нейроэндокринной дифференцировки. Этот кислый, трансмембранный гликопротеин мелких пресинаптических везикул является протеином мембранных каналов. В периферических тканях он экспрессируется в нервных и нейроэндокринных клетках, таких как ганглиозные клетки, аксоны, параганглии, и в большинстве клеток дисперсной нейроэндокринной системы. В меланомах человека этот маркер определяется крайне редко, однако у собак обнаруживается чаще и доказывает нейроэктодермальное происхождение опухоли.

Виментин. Белок промежуточных филаментов соединительных тканей и других тканей мезодермального происхождения. Динамическая природа виментина важна для изменения формы клеток. Именно виментин обеспечивает прочность клеток и их устойчивость к механическому стрессу. Поэтому считается, что виментин – компонент цитоскелета, отвечающий за поддержание целостности клетки. Виментин используется в качестве онкомаркера саркомы для идентификации мезенхимы.

S 100 белок. Нормальные и опухолевые меланоциты  являются устойчиво позитивными, и  протеин S100 присутствует практически во всех доброкачественных и злокачественных меланоцитарных опухолях. Он экспрессируется в первичной, а также метастатических меланомах. Диагноз «меланома» всегда должен быть исключен, когда рассматривается эпителиоидная или с виду веретенообразная мезенхимальная опухоль. Несмотря на отсутствие опухолевой специфичности, протеин S100 остается важным скринирующим  маркером в выявлении метастатической меланомы.

Описание клинического случая

В ветеринарный центр патоморфологии и лабораторной диагностики поступил материал на исследование: ткань опухоли слизистой оболочки рта собаки породы немецкая овчарка, возраст 12 лет. Опухолевый узел диаметром до 4 см, поверхность опухоли изъязвлена. Элементов костной ткани препарат не содержал. На данном материале было проведено гистологическое исследование со стандартной гистологической окраской гематоксилином и эозином. Описание гистологического препарата: опухоль образована атипичными полиморфными клетками веретенообразной и вытянутой формы. Клетки расположены в виде пучков, тяжей и завихрений. Ядра клеток крупные, овальные, расположены центрально или эксцентрично, содержат неравномерно распределенный глыбчатый хроматин и множественные крупные нуклеолы. Цитоплазма клеток умеренная, базофильная. Много патологических фигур митоза. Васкуляризация опухоли скудная, выявляются очаги некроза. Заключение: низкодифференцированная опухоль неясного генеза. Необходимо провести дифференциальную диагностику между фибросаркомой и веретеноклеточной меланомой.

Было принято решение о проведении ИГХ-исследования. Выбранная панель антител включала в себя маркеры мезенхимальной, нейроэктодермальной, эпителиальной и лимфоидной дифференцировки. Положительную экспрессию дали: HMB 45, S100, виментин, syn. Отрицательная экспрессия CD 3, pax 5, p 63, chrom.

По результатам проведенных ИГХ-окрасок был поставлен окончательный диагноз «меланома».

 Заключение

ИГХ-метод исследования является методом выбора в диагностике низкодифференцированных новообразований. Метод является дополнительным и проводится после классического рутинного гистологического анализа. По результатам гистологического исследования врач-патолог определяет панель используемых антител, ориентируясь на гистогенез опухоли и степень ее дифференцировки. Каждая лаборатория определяет собственные алгоритмы ИГХ-исследования, учитывая потребности и задачи клиентов.

Литература

1. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н., Горячкина В.Л. Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии. М.: Медицинское информационное агентство, 2002.

2. Бикхардт К. Клиническая ветеринарная патофизиология. М.: Медицина, 2001.

3. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 2001.

4. Панцырев Ю.М. Клиническая хирургия. М.: Медицина, 1988.

5. Пальцев М.А., Пономарев А.Б., Берестова А.В. Атлас по патологической анатомии. М.: Медицина, 2003.

6. С труков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1979.

 

Назад в раздел