Конъюнктивин - изучение безопасности при длительном применении препарата на лабораторных животных

Еще фото

Автор (ы):  Н. Данилевская, д.в.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии и токсикологии им. И.Е. Мозгова, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, Р. Тухфатова, к.б.н., доцент кафедры фармакологии и токсикологии им. И.Е. Мозгова, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, Т. Абгалина, DVM
Журнал:  №3 - 2012

На правах рекламы

Сокращения

АЛТ – аланинаминотрансфераза

МCH – среднеклеточное содержание гемоглобина

АСТ – аспартатаминотрансфераза

м-РНК – матричная рНК

ГГТ – гамма-глутамилтрансфераза

НПВС – нестероидные противовоспалительные средства

КФ – кислая фосфатаза

СПВС – стероидные противовоспалительные средства

КФК – креатинфосфокиназа

ПГ – простагландины

ЛДГ – лактатдегидрогеназа

СОЭ – скорость оседания эритроцитов

ЩФ – щелочная фосфатаза

Hb – гемоглобин

В ветеринарной практике у мелких домашних животных все чаще регистрируют заболевания глаз, которые сопровождаются воспалительным, аллергическим и бак­териальным компонентами. Такие заболевания могут быть обусловлены породной предрасположенностью (энтропия, экзофтальм, эпифора, кератоконъюнктивит Сикка, макроблефария, паннус, пигментный кератит и др.), прочими причинами, включая последствия хирургических вмешательств.

Фармакокоррекцию проводят, как правило, противовоспалительными препаратами и антимикробными средствами. Использование большого количества фарма­кологических препаратов для лечения заболеваний глаз у мелких домашних животных не всегда удобно. Глазные капли надо закапывать с интервалом в 10-15 минут, чтобы препарат успел всосаться. Каждый раз требуется фиксация животного, эта процедура вызывает беспокойство и стресс, что особенно неблагоприятно в случаях, когда лечение проводится длительным курсом. В связи с этим удобны комплексные препараты с бактерицидными, противовоспалительными и противоотечными свой­ствами.

Целью настоящей работы являлось изучение на лабораторных животных безопасности длительного применения нового фармакологического препарата Конъюнктивин.

Материалы и методы

Работа проведена на кафедре фармакологии и токсикологии им. И.Е. Мозгова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Конъюнктивин – лекарственное средство в форме офтальмологического раствора для лечения и профилактики конъюнктивитов, кератитов, кератоконъюнктивитов и блефаритов у собак и кошек. Включает в качестве действующих веществ ципрофлоксацина гидрохлорид и дексаметазон. Обладает выраженными анти­бактериальными, противовоспалительными и противоаллергическими свойствами.

Для изучения безопасности препарата при его длительном применении сформировали 2 группы белых лабораторных крыс 3-хмесячного возраста: подопытную (10 голов) и контрольную (10 голов). В течение 30 суток (срока, в 5 раз превышающего рекомендуемый) крысам подопытной группы ежедневно в один глаз капали Конъюнктивин в дозе, рекомендуемой для собаки согласно инструкции по применению. Животным контрольной группы закапывали стерильный физиологический раствор в аналогичном количестве. В течение срока эксперимента проводили клинический осмотр крыс подопытной и контрольной групп. Определяли наличие изменений внешнего вида, поведения, аппетита, а также различий в живой массе.

На 15-е и 30-е сутки проводили внешнее офтальмологическое обследование животных двойным слепым методом. Офтальмолог не был ознакомлен с тем, крыс опытной или контрольной групп он осматривал, а также в который из двух глаз закапывали Конъюнктивин.

Расширенные гематологические исследования проводили на 15-е и 30-е сутки эксперимента. Использовали прибор Abacus (Junior 5 Vet). Метод отбора пробы – система с открытой пробиркой с автоматическим пробоотборником. Определяли СОЭ, гематокрит, уровень гемоглобина, эритроцитов, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина, количество тромбоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов.

Биохимические исследования также проводили на 15-е и 30-е сутки эксперимента. Использовали прибор Bio-Chem SA с встроенной проточной кюветой. Определяли в сыворотке крови уровни АЛТ, АСТ, ГГТ, ЩФ, КФ, ЛДГ, амилазы, а также альбумин, билирубин прямой и общий, глюкозу, мочевину, креатинин, общий белок, холестерин, кальций и фосфор. Результаты обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы.

Результаты исследований и их обсуждение

При ежедневном клиническом осмотре изменений внешнего вида, поведения, аппетита, состоянии физиологических систем, а также отличий в живой массе у жи­вотных подопытной группы по сравнению с контролем не отмечали в течение всего периода эксперимента (30 суток наблюдений). При двукратном специализированном внешнем офтальмологическом осмотре на 15-е и 30-е сутки эксперимента отличий в состоянии глаз у крыс подопытной и контрольной групп не выявили.

Установили, что, несмотря на длительное применение препарата, в состав которых наряду с активным антибактериальным компонентом входил дексаметазон, статистически значимых влияний на эритропоэз и лейкопоэз не было (Табл. 1). Показатели гемоглобина и гематокрита соответствовали референтным уровням, характерным для физиологической нормы данного вида животных как на 15-е, так и на 30-е сутки эксперимента. Содержание лимфоцитов в опытной группе на 30-е сутки было выше на 12,85% по сравнению с контролем, что говорит об отсутствии влияния стероидного компонента препарата на лимфопоэз.

При проведении биохимических исследований сыворотки крови статистически значимых различий в показателях крыс подопытной и контрольной группы также не отмечено. Уровень общего белка и альбуминов у животных опытной группы составил 76,4 + 1,16 г/л, что на 4,08% выше показателя контрольной группы (73,4 + 1,39 г/л). Сходная динамика была отмечена и при исследовании альбуминов в сыворотке крови. Нормальные уровни общего белка и альбуминов в сыворотке крови свидетельствуют о том, что протеины не используются в качестве энергетического компонента, что характерно для резорбтивного действия глюкокортикоидов.

У крыс, которым в глаз в течение 30 суток закапывали Конъюнктивин, не был изменен по сравнению с нормой и уровень глюкозы в сыворотке крови. Показатель составил соответственно 4,07 + 0,58 моль/л в опытной и 4,1 + 1,33 моль/л в контроле. Таким образом, отсутствовала и гипергликемия, характерная СПВС.

Уровень амилазы не отличался у экспериментальных и контрольных животных, что свидетельствует об отсутствии отрицательных воздействий на поджелудочную железу.

При анализе биохимических параметров, характеризующих функциональное состояние печени, установили, что применение Конъюнктивина крысам в течение 30 дней не привело к изменению уровней конъюгированного и неконъюгированного билирубина. Следовательно, препарат не провоцировал развитие холестаза и не нарушал функциональную способность печени к конъюгации при метаболической фазе биотрансформации эндогенных веществ или ксенобиотиков.

Уровни АЛТ и АСТ в сыворотке крови крыс подопытной опытной группы остались в пределах нормы и были ниже по сравнению с показателем у животных контрольной группы соответственно на 10,6% и 4,3% (Рис. 2).

Известно, что АЛТ и АСТ – внутриклеточные ферменты, и их повышенное количество в сыворотке крови свидетельствует о гибели печеночных клеток. Таким образом, результаты проведенных исследований показали отсутствие гепатотоксичности при длительном применении препарата. Напротив, уровень холестерола в сыворотке крови у подопытных крыс достиг физиологической нормы (2,1 + 0,44 моль/л), тогда как в контрольной группе он был понижен (0,73 + 0,01 моль/л) по сравнению с нормой (0,96-2,37 моль/л). Известно, что холестерол синтезируется в печени и является одним из показателей ее функциональной активности. Следовательно, с учетом параллельных позитивных изменений уровней АЛТ и АСТ, а также нормальных значений билирубина можно предположить, что малые дозы дексаметазона, которые все-таки попали в организм при закапывании капель в глаз, оказали гепатопротекторное действие, улучшив функциональное состояние печени у подопытных крыс.

При исследовании уровней мочевины, креатинина, ЩФ, КФ, ЛДГ, триглицеридов, кальция, фосфора в сыворотке крови у подопытных крыс изменений по сравнению с контрольными животными и референтным уровнем нормы для данного вида животных не отмечено.

Обсуждение результатов эксперимента

Известно, что разработка эффективных фармакологических препаратов с противомикробным, противоотечным и противовоспалительным действием для лечения заболеваний глаз является актуальной задачей.

Ципрофлоксацина гидрохлорид, входящий в состав Конъюнктивина, оказывает бактерицидное действие в отношении большинства грамположительных и грамот-рицательных микроорганизмов, а также в отношении микоплазм.

Важно, что он действует на микроорганизм и в период роста, и в период покоя, что определяется механизмом действия ципрофлоксацина гидрохлорида: происходит ингибирование ДНК-гиразы бактерий (топоизомераз II и IV, ответственных за процесс укладки хромосомной ДНК в суперспираль вокруг ядерной РНК). При разрушении структуры ДНК и нарушении мембраны бактериальной клетки не только нарушается биосинтез ДНК, рост и деление бактерий. Выраженные морфологические изменения приводят к быстрой гибели микробной клетки.

Ципрофлоксацина гидрохлорид обладает широким спектром противомикробного действия, наиболее активен в отношении грамотрицательных бактерий, менее выражено влияние на анаэробов. Согласно данным литературы, он оказывает действие на Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Moraxella (Branhamella) catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Brucella meli-tensis, Edwardsiella tarda, Legionella pneumophila, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis.

В кислой среде активность ципрофлоксацина снижается. Он быстро элиминирует R-плазмиды, что препятствует развитию резистентности со стороны микроорганизмов к препарату.

Хочется обратить внимание практикующих врачей на то, что резистентность к ципрофлоксацина гидрохлориду развивается медленно и постепенно («многоступенча­тый» тип), отсутствует перекрестная устойчивость с пенициллинами, цефалоспоринами, аминогликозидами. Несмотря на это, не следует пренебрегать необходимыми микробиологическими исследованиями. В конкретном случае, особенно при микоплазмозе, могут циркулировать штаммы, малочувствительные к данному препарату.

Также необходимо помнить, что многие стафилококки, устойчивые к метициллину, резистентны обычно и к ципрофлоксацину. К нему умеренно чувствительны Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Mycobacterium avium и некоторые другие микроорганизмы с внутриклеточной локализацией. К ципрофлоксацину ре­зистентны большинство штаммов Burkholderia cepacia, некоторые штаммы Stenotrophomonas maltophilia, а также Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Pseu-domonas maltophilia, Ureaplasma urealyticum, Clostri-dium difficile, Nocardia asteroides. Неэффективен он в отношении Treponema pallidum.

Положительным свойством ципрофлоксацина является его низкая токсичность и канцерогенность. В опытах на крысах и мышах, получавших ципрофлоксацин в дозах, в 6 раз превышающих обычную суточную дозу для человека, неблагоприятного действия не выявлено.

Однако при местном применении ципрофлоксацина и содержащих его комплексных препаратов возможно побочное действие: аллергические реакции, зуд, жжение, легкая болезненность и гиперемия, отек век и др. Поэтому применение препаратов возможно строго по показаниям, по назначению врача и при его наблюдении за животным.

Дексаметазон относится к группе синтетических аналогов глюкокортикоидов, проникает во все ткани глаза, обеспечивая устойчивый терапевтический уровень активных компонентов. Он обладает противовоспалительным и противоаллергическим действием. Взаимодействует со специфическими цитоплазматическими рецепторами клеток и образует комплекс, проникающий в ядро клетки; вызывает экспрессию или депрессию мРНК, изменяя образование на рибосомах белков, опосредующих клеточные эффекты, в т.ч. синтез липокортина. Липокортин угнетает фосфолипазу A2, подав ляет либерацию арахидоновой кислоты и ингибирует биосинтез эндоперекисей, ПГ, лейкотриенов, способствующих процессам воспаления, аллергии и др. Пре­пятствует высвобождению медиаторов воспаления из эозинофилов и тучных клеток. Тормозит активность гиалуронидазы, коллагеназы и протеаз, нормализует функции межклеточного матрикса хрящевой и костной ткани. Снижает проницаемость капилляров, стабилизирует клеточные мембраны, в т.ч., лизосомальные, угнетает высвобождение цитокинов (интерлейкинов 1 и 2, гамма-интерферона) из лимфоцитов и макрофагов. Влияет на все фазы воспаления, антипролиферативный эффект обусловлен торможением миграции моноцитов в воспалительный очаг и пролиферации фибробластов. В высоких дозах или при длительном применении вызывает инволюцию лимфоидной ткани и лимфопению, что обусловливает иммунодепрессию. Кроме уменьшения числа Т-лимфоцитов, снижается их влияние на В-лимфоциты и тормозится выработка иммуноглобулинов. Влияние на систему комплемента заключается в снижении образования и повышении распада ее компонентов. Противоаллергическое действие является следствием торможения синтеза и секреции медиаторов аллергии и уменьшением числа базофилов. Восстанавливает чувствительность адренорецепторов к катехоламинам. Ускоряет катаболизм белков и уменьшает их содержание в плазме, снижает утилизацию глюкозы периферическими тканями и повышает глюконеогенез в печени. Стимулирует образование ферментных белков в печени, сурфактанта, фибриногена, эритропоэтина, липомодулина. Вызывает перераспределение жира (повышает липолиз жировой ткани конечностей и отложение жира в верхней половине туловища и на лице). Способствует образованию высших жирных кислот и триглицеридов. Уменьшает всасывание и увеличивает выведение кальция; задерживает натрий и воду, секрецию АКТГ. Обладает противошоковым дей­ствием.

После закапывания в конъюнктивальный мешок хорошо проникает в эпителий роговицы и конъюнктиву, при этом в водянистой влаге глаза создаются терапев­тические концентрации лекарственного средства. При воспалении или повреждении слизистой оболочки скорость проникновения увеличивается.

В наших исследованиях изменений, характерных для резорбтивного влияния дексаметазона на крыс после применения препарата Конъюнктивин в глаз в течение 30 суток не отмечено: не выявлено лимфопении или эритроцитоза. Уровень альбуминов и белка в сыворотке крови оставался нормальным, не отмечено гипергликемии или каких-либо других изменений гомеостаза у животных.

Следует отметить, что эксперимент проводили на здоровых крысах, у которых не было офтальмологической патологии и нарушений целостности структур глаза.

При применении препарата Конъюнктивин следует помнить, что назначение должно производиться строго в соответствии с инструкцией по применению. Данные литературы свидетельствуют о том, что при длительном (более 3 недель) применении препаратов, включающих НПВС животным с офтальмологической патологией возможно повышение внутриглазного давления, снижение остроты зрения и выпадение полей зрения, формирование задней субкапсулярной катаракты, истончение и перфорация роговой оболочки. Возможна гиперчувствительность к дексаметазону или бензалкония хлориду (может развиться конъюнктивит и блефарит). При резистентности бактериальной флоры к противомикробному компоненту возможно распространение инфекции. Противопоказаниями являются вирусные, грибковые, туберкулезные поражения глаз, в т.ч. кератит, вызванный Herpes simplex, а также вирусный конъюнктивит, нарушение целостности эпителия роговицы, трахома, глаукома.


Назад в раздел